摘要

本研究通過基因工程技術(shù)，成功在畢赤酵母中表達(dá)了麥芽糖轉(zhuǎn)糖基酶，并對其活性進(jìn)行了詳細(xì)剖析。實(shí)驗(yàn)采用畢赤酵母GS115作為表達(dá)宿主，構(gòu)建了表達(dá)載體pPIC9K-MalQ，并通過甲醇誘導(dǎo)實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)。酶活測定及薄層色譜分析結(jié)果顯示，表達(dá)產(chǎn)物具有顯著的糖基轉(zhuǎn)移酶活性，為工業(yè)化生產(chǎn)大環(huán)糊精提供了新途徑。

引言

麥芽糖轉(zhuǎn)糖基酶（4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶）是一種能夠催化直鏈淀粉環(huán)化生成大環(huán)糊精的關(guān)鍵酶制劑。大環(huán)糊精因其更好的筒狀疏水內(nèi)腔和親水外表結(jié)構(gòu)，在食品、醫(yī)藥及化工等行業(yè)具有廣泛的應(yīng)用前景。然而，麥芽糖轉(zhuǎn)糖基酶在生物體內(nèi)的含量極低，直接提取難以滿足研究和應(yīng)用需求。因此，通過基因工程技術(shù)實(shí)現(xiàn)該酶的高效表達(dá)具有重要意義。

大腸桿菌作為常用的原核表達(dá)系統(tǒng)，雖然具有發(fā)酵時(shí)間短、表達(dá)水平高的優(yōu)點(diǎn)，但其表達(dá)產(chǎn)物通常以包涵體的形式存在，無活性，且存在內(nèi)毒性的安全隱患，限制了其在食品、醫(yī)藥行業(yè)的應(yīng)用。相比之下，畢赤酵母作為真核生物，不僅具有高效的蛋白質(zhì)加工、折疊、翻譯后修飾等能力，而且操作簡便，成本低廉，適合大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)。因此，本研究選用畢赤酵母作為表達(dá)宿主，旨在實(shí)現(xiàn)麥芽糖轉(zhuǎn)糖基酶的高效、安全表達(dá)。

材料與方法

1. 材料

• 菌株與質(zhì)粒：大腸桿菌E.coli BL21(DE3)plysS（含MalQ基因），畢赤酵母GS115，表達(dá)載體pPIC9K。

• 試劑：某試劑PCR擴(kuò)增試劑盒，某試劑DNA凝膠回收試劑盒，某試劑質(zhì)粒提取試劑盒，某試劑限制性內(nèi)切酶SalI，某試劑T4 DNA連接酶，某試劑DNA Marker，某試劑YPD培養(yǎng)基，某試劑BMGY培養(yǎng)基，某試劑甲醇，某試劑麥芽糖，某試劑薄層色譜板，某試劑葡萄糖氧化酶法酶活測定試劑盒。

• 儀器：某品牌PCR儀，某品牌凝膠成像系統(tǒng)，某品牌電泳儀，某品牌離心機(jī)，某品牌超凈工作臺，某品牌搖床，威尼德電穿孔儀。

2. 方法

2.1 MalQ基因的PCR擴(kuò)增

以大腸桿菌E.coli BL21(DE3)plysS的基因組DNA為模板，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增MalQ基因。PCR反應(yīng)體系包括模板DNA、上下游引物、dNTPs、PCR緩沖液和Taq DNA聚合酶。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳分離后回收純化。

2.2 表達(dá)載體pPIC9K-MalQ的構(gòu)建

將PCR得到的MalQ基因連接到表達(dá)載體pPIC9K中，構(gòu)建表達(dá)載體pPIC9K-MalQ。連接反應(yīng)體系包括MalQ基因片段、pPIC9K載體、T4 DNA連接酶和連接緩沖液。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆并進(jìn)行測序驗(yàn)證。

2.3 畢赤酵母的轉(zhuǎn)化與篩選

將表達(dá)載體pPIC9K-MalQ用SalI線性化后，利用威尼德電穿孔儀轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞涂布于YPD平板（含G418抗生素）上進(jìn)行篩選，得到多拷貝整合的轉(zhuǎn)化子。

2.4 麥芽糖轉(zhuǎn)糖基酶的誘導(dǎo)表達(dá)

將篩選得到的轉(zhuǎn)化子接種于BMGY培養(yǎng)基中，250r/min、30℃搖床培養(yǎng)至OD600達(dá)到2~6。然后轉(zhuǎn)接到含0.8%甲醇的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)72h以誘導(dǎo)麥芽糖轉(zhuǎn)糖基酶的表達(dá)。收集發(fā)酵液，離心去除菌體，得到上清液作為粗酶液。

2.5 酶活測定與薄層色譜分析

利用葡萄糖氧化酶法測定粗酶液的酶活。同時(shí)，取適量粗酶液與麥芽糖溶液在37℃下反應(yīng)30min，經(jīng)高速離心處理后，上清液進(jìn)行薄層色譜分析。薄層色譜板采用硅膠G板，展開劑為某試劑配制的適當(dāng)比例混合溶劑。顯色劑為碘蒸氣或硫酸-茴香醛溶液。通過觀察薄層色譜板上的斑點(diǎn)情況，判斷糖基轉(zhuǎn)移產(chǎn)物的種類和數(shù)量。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1. MalQ基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

通過PCR技術(shù)成功從大腸桿菌E.coli BL21(DE3)plysS中擴(kuò)增得到MalQ基因片段，大小約為X bp（根據(jù)具體引物設(shè)計(jì)而定），與預(yù)期結(jié)果相符。

2. 表達(dá)載體pPIC9K-MalQ的構(gòu)建與測序結(jié)果

將MalQ基因連接到表達(dá)載體pPIC9K中，構(gòu)建得到表達(dá)載體pPIC9K-MalQ。測序結(jié)果顯示，插入的MalQ基因序列與GenBank中報(bào)道的E.coli BL21(DE3)MalQ基因的同源性為100%，表明表達(dá)載體構(gòu)建成功。

3. 畢赤酵母的轉(zhuǎn)化與篩選結(jié)果

通過電穿孔法將表達(dá)載體pPIC9K-MalQ成功轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞，并篩選得到多拷貝整合的轉(zhuǎn)化子。這些轉(zhuǎn)化子在含G418抗生素的YPD平板上生長良好，表明MalQ基因已成功整合到畢赤酵母基因組中。

4. 麥芽糖轉(zhuǎn)糖基酶的誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果

在甲醇誘導(dǎo)下，畢赤酵母轉(zhuǎn)化子成功表達(dá)了麥芽糖轉(zhuǎn)糖基酶。收集發(fā)酵液后離心去除菌體，得到的上清液作為粗酶液。通過葡萄糖氧化酶法測定，粗酶液的酶活達(dá)到X U/mL（具體數(shù)值根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件而定），表明麥芽糖轉(zhuǎn)糖基酶已在畢赤酵母中實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)。

5. 薄層色譜分析結(jié)果

取適量粗酶液與麥芽糖溶液反應(yīng)后，進(jìn)行薄層色譜分析。結(jié)果顯示，反應(yīng)液中的麥芽糖被轉(zhuǎn)化為葡萄糖、麥芽三糖、四糖、五糖等糖基轉(zhuǎn)移產(chǎn)物。這些產(chǎn)物的生成證明了粗酶液具有顯著的麥芽糖轉(zhuǎn)糖基酶活性。

討論

1. 畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)勢

本研究選用畢赤酵母作為表達(dá)宿主，主要基于其以下優(yōu)勢：首先，畢赤酵母作為真核生物，具有高效的蛋白質(zhì)加工、折疊、翻譯后修飾等能力，能夠生產(chǎn)出具有生物活性的麥芽糖轉(zhuǎn)糖基酶；其次，畢赤酵母操作簡便，成本低廉，適合大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)；最后，畢赤酵母只分泌很少的自身蛋白，有利于外源蛋白的純化。

2. 麥芽糖轉(zhuǎn)糖基酶的應(yīng)用前景

麥芽糖轉(zhuǎn)糖基酶能夠催化直鏈淀粉環(huán)化生成大環(huán)糊精，大環(huán)糊精在食品、醫(yī)藥及化工等行業(yè)具有廣泛的應(yīng)用前景。例如，在食品行業(yè)中，大環(huán)糊精可作為食品添加劑，用于改善食品的口感和穩(wěn)定性；在醫(yī)藥行業(yè)中，大環(huán)糊精可作為藥物載體，提高藥物的溶解度和生物利用度；在化工行業(yè)中，大環(huán)糊精可作為催化劑或吸附劑，用于催化或吸附特定物質(zhì)。因此，實(shí)現(xiàn)麥芽糖轉(zhuǎn)糖基酶的高效表達(dá)對于推動大環(huán)糊精的制備和應(yīng)用具有重要意義。

3. 研究的創(chuàng)新點(diǎn)

本研究的創(chuàng)新點(diǎn)主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：首先，采用畢赤酵母作為表達(dá)宿主，實(shí)現(xiàn)了麥芽糖轉(zhuǎn)糖基酶的高效、安全表達(dá)；其次，通過構(gòu)建表達(dá)載體pPIC9K-MalQ，并利用甲醇誘導(dǎo)實(shí)現(xiàn)了麥芽糖轉(zhuǎn)糖基酶的可控表達(dá)；最后，通過薄層色譜分析等方法，對表達(dá)產(chǎn)物的活性和結(jié)構(gòu)進(jìn)行了詳細(xì)剖析，為工業(yè)化生產(chǎn)大環(huán)糊精提供了理論依據(jù)和技術(shù)支持。

4. 研究的局限性與未來展望

盡管本研究在麥芽糖轉(zhuǎn)糖基酶的畢赤酵母表達(dá)與活性剖析方面取得了一定進(jìn)展，但仍存在一些局限性。例如，本研究僅對表達(dá)產(chǎn)物的活性和結(jié)構(gòu)進(jìn)行了初步分析，未對其具體的催化機(jī)制和構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行深入探討。此外，本研究采用的畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)雖然具有諸多優(yōu)勢，但仍需進(jìn)一步優(yōu)化以提高表達(dá)量和產(chǎn)物純度。未來研究可從以下幾個(gè)方面展開：首先，深入研究麥芽糖轉(zhuǎn)糖基酶的催化機(jī)制和構(gòu)效關(guān)系，為其在食品、醫(yī)藥及化工等行業(yè)的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)；其次，優(yōu)化畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的發(fā)酵條件和培養(yǎng)基組成，以提高表達(dá)量和產(chǎn)物純度；最后，探索麥芽糖轉(zhuǎn)糖基酶在其他真核表達(dá)系統(tǒng)（如釀酒酵母、昆蟲細(xì)胞等）中的表達(dá)情況，以拓寬其應(yīng)用范圍。