摘要

本文介紹了一種陽性轉(zhuǎn)染細胞親和分選方法及試劑盒，該方法通過構(gòu)建一種基于細胞膜表面定位熒光蛋白標(biāo)簽的親和分選系統(tǒng)，實現(xiàn)了對轉(zhuǎn)染陽性細胞的高效分選。實驗結(jié)果表明，該系統(tǒng)具有操作簡便、細胞損傷小、適用性廣等優(yōu)點，為基因功能研究提供了有力工具。

引言

細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)是現(xiàn)代分子生物學(xué)研究中的一種重要技術(shù)手段，它可以將外源DNA、RNA或其他生物大分子導(dǎo)入細胞內(nèi)，從而實現(xiàn)對細胞功能的研究和調(diào)控。然而，在難轉(zhuǎn)染細胞中，如淋巴瘤/白血病細胞以及原代細胞，轉(zhuǎn)染效率往往較低，這限制了這些細胞為基礎(chǔ)的功能研究。因此，如何在難轉(zhuǎn)染細胞中進一步提高陽性率成為關(guān)鍵問題。

目前，提高陽性細胞比例的策略主要包括抗生素藥物篩選、流式細胞熒光分選（FACS）和磁性細胞分選（MACS）等方法。然而，這些方法存在操作復(fù)雜、實驗周期長、儀器昂貴、細胞損傷大等局限性。因此，開發(fā)一種操作快速、簡單，成本低，適用性廣，并且對細胞干擾較小的富集轉(zhuǎn)染陽性細胞的方法顯得尤為重要。

本研究旨在構(gòu)建一種基于磁珠親和分選的細胞分離系統(tǒng)，實現(xiàn)快速、高效的富集轉(zhuǎn)染陽性細胞。通過構(gòu)建一種可高效分選轉(zhuǎn)染陽性細胞的親和分選系統(tǒng)，在表達載體上編碼融合了膜定位信號、親和標(biāo)簽標(biāo)記的熒光蛋白，熒光蛋白和膜定位信號在轉(zhuǎn)染陽性的細胞融合表達，從而實現(xiàn)對轉(zhuǎn)染陽性細胞的高效分選。

材料與方法

材料

1. 細胞株：Lenti-X293T細胞、前列腺癌細胞22Rv1、白血病細胞K-562及Jurkat細胞。

2. 表達載體：包含膜定位信號、熒光蛋白及親和分選標(biāo)簽的編碼序列的質(zhì)粒載體，如pEGFP-C2。

3. 磁珠：Magrose Strep-Tactin磁珠。

4. 試劑：某品牌脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑、某品牌DPBS溶液、某品牌BSA。

5. 儀器：某品牌流式細胞儀、某品牌激光共聚焦熒光顯微鏡。

方法

1. 細胞培養(yǎng)：將Lenti-X293T細胞、前列腺癌細胞22Rv1、白血病細胞K-562及Jurkat細胞在相應(yīng)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期。

2. 基因構(gòu)建：通過PCR擴增目的基因，并克隆至載體pEGFP-C2中，構(gòu)建包含膜定位信號、親和分選標(biāo)簽及熒光蛋白的表達框。具體步驟如下：

• 使用SignalP-5.0 Server在線分析獲取膜定位信號的編碼序列以及信號肽剪切位點。

• 通過多重PCR將膜定位信號、親和分選標(biāo)簽及熒光蛋白的編碼序列融合，并通過AgeI/BglII酶切連接的方式克隆到pEGFP-C2載體中。

3. 轉(zhuǎn)染：采用某品牌脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將構(gòu)建好的質(zhì)粒載體導(dǎo)入細胞中。

4. 親和分選：

• 將轉(zhuǎn)染后的細胞與Magrose Strep-Tactin磁珠孵育，使磁珠與細胞表面的親和標(biāo)簽結(jié)合。

• 通過外加磁場或自然沉降方式固定磁珠-細胞復(fù)合物。

• 使用溫和的洗脫緩沖液（含有0.05~0.15%BSA的DPBS溶液）將結(jié)合的細胞從磁珠上釋放出來，實現(xiàn)陽性細胞的親和分選。

5. 檢測與定量：

• 使用某品牌流式細胞儀檢測分選前后細胞的陽性率。

• 通過激光共聚焦熒光顯微鏡觀察不同分選標(biāo)簽在細胞膜外層的定位情況。

實驗結(jié)果

1. 分選標(biāo)簽的細胞膜定位：將六種不同分選標(biāo)簽的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染Lenti-X293T細胞，通過激光共聚焦熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，六種基于TST-EGFP的分選標(biāo)簽分子都可以高水平的表達并且有效的定位到細胞膜上。其中，三種GPI膜錨定類型的分選標(biāo)簽不僅具有良好的膜定位效果，并且細胞擁有正常的形態(tài)。

2. 轉(zhuǎn)染陽性細胞的親和分選：將六種分選標(biāo)簽質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到三種細胞中，包括懸浮生長的白血病細胞K-562，貼壁生長的Lenti-X293T細胞和前列腺癌細胞22Rv1，使用Strep-Tactin磁珠分選陽性細胞并通過流式細胞術(shù)測定不同變體對陽性細胞的分選效率。結(jié)果表明，六種分選標(biāo)簽在不同細胞系中均表現(xiàn)出了有效的富集轉(zhuǎn)染陽性細胞的能力。尤其是基于GPI膜錨定的三種分選標(biāo)簽（TST-EGFP-GPI BY55，TST-EGFP-GPI DAF，TST-EGFP-GPI CEAM7），其富集陽性細胞的能力顯著高于基于跨膜結(jié)構(gòu)域的分選標(biāo)簽。

3. 難轉(zhuǎn)染細胞的分選效果：在難轉(zhuǎn)染的Jurkat白血病細胞中對三種基于GPI膜錨定分選標(biāo)簽進行了轉(zhuǎn)染陽性細胞分選實驗。結(jié)果表明，這三種分選標(biāo)簽也表現(xiàn)出了高效的陽性細胞分離能力。經(jīng)過分選，TST-EGFP-GPI BY55，TST-EGFP-GPI DAF，和TST-EGFP-GPI CEAM7三種分選標(biāo)簽可將陽性細胞比例從13%分別提高到67%，77%和63%。

4. 分選效率的優(yōu)化：通過自然沉降的方式而不是依賴外部磁場的作用分離結(jié)合了細胞的磁珠，發(fā)現(xiàn)在K-562細胞中經(jīng)過TST-EGFP-GPI BY55分選標(biāo)簽富集之后，轉(zhuǎn)染陽性細胞的比例達到95%以上。

討論

本研究構(gòu)建了一種基于磁珠親和分選的細胞分離系統(tǒng)，實現(xiàn)了對轉(zhuǎn)染陽性細胞的高效分選。該系統(tǒng)通過在表達載體上編碼融合了膜定位信號、親和標(biāo)簽標(biāo)記的熒光蛋白，使熒光蛋白和膜定位信號在轉(zhuǎn)染陽性的細胞融合表達?；谠撚H和分選系統(tǒng)，膜定位信號將熒光蛋白定位到細胞膜外表面，確保了技術(shù)人員可以直觀的通過流式細胞儀或者熒光顯微鏡來評估轉(zhuǎn)染陽性細胞比例。

親和標(biāo)簽的使用讓技術(shù)人員可以通過磁珠分選的方式來快速高效的分離轉(zhuǎn)染陽性細胞。在本研究中，Twin-Strep-tag（TST）作為一種理想的親和標(biāo)簽短肽，與Strep-Tactin蛋白具有更高的親和力，被融合到綠色熒光蛋白分子的N端，作為親和分選標(biāo)簽分子。實驗結(jié)果表明，基于GPI膜錨定的分選標(biāo)簽具有更高的富集陽性細胞的能力。

此外，該系統(tǒng)的優(yōu)勢在于操作簡便、細胞損傷小、適用性廣。與現(xiàn)有的流式細胞熒光分選（FACS）和磁性細胞分選（MACS）等方法相比，該系統(tǒng)不需要昂貴的實驗儀器，實驗成本低，且操作簡便。通過調(diào)整磁珠的使用量即可在同一時間和批次處理不同數(shù)量級的細胞樣品，省時省力，且通量幾乎不受限制。

在難轉(zhuǎn)染細胞中，該系統(tǒng)也表現(xiàn)出了高效的陽性細胞分離能力。這對于以難轉(zhuǎn)染細胞為基礎(chǔ)的功能研究具有重要意義。通過該系統(tǒng)，可以實現(xiàn)對難轉(zhuǎn)染細胞中基因遞送效率的顯著提高，為后續(xù)的基因功能研究提供了有力工具。

研究的創(chuàng)新與應(yīng)用前景

本研究的創(chuàng)新之處在于構(gòu)建了一種基于細胞膜表面定位熒光蛋白標(biāo)簽的親和分選系統(tǒng)，實現(xiàn)了對轉(zhuǎn)染陽性細胞的高效分選。該系統(tǒng)具有操作簡便、細胞損傷小、適用性廣等優(yōu)點，為基因功能研究提供了有力工具。

在應(yīng)用前景方面，該系統(tǒng)可以廣泛應(yīng)用于各種類型的實驗研究，包括基因過表達分析、基因敲降分析、報告基因分析、基因編輯分析以及相關(guān)的細胞功能研究實驗等。通過將分選標(biāo)簽的表達框插入到其他類型的載體上，即可將該轉(zhuǎn)染陽性細胞的分選方法應(yīng)用于不同類型的實驗研究。

此外，該系統(tǒng)還可以與其他技術(shù)相結(jié)合，如基因組編輯技術(shù)（如CRISPR/Cas9）、高通量測序技術(shù)等，進一步拓展其在基因功能研究中的應(yīng)用范圍。

結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了一種基于磁珠親和分選的細胞分離系統(tǒng)，實現(xiàn)了對轉(zhuǎn)染陽性細胞的高效分選。該系統(tǒng)通過在表達載體上編碼融合了膜定位信號、親和標(biāo)簽標(biāo)記的熒光蛋白，使熒光蛋白和膜定位信號在轉(zhuǎn)染陽性的細胞融合表達。實驗結(jié)果表明，該系統(tǒng)具有操作簡便、細胞損傷小、適用性廣等優(yōu)點，為基因功能研究提供了有力工具。

在未來的研究中，將進一步優(yōu)化該系統(tǒng)，提高其分選效率和穩(wěn)定性。同時，將探索該系統(tǒng)在更多類型細胞中的應(yīng)用，以及與其他技術(shù)相結(jié)合的可能性，為基因功能研究提供更加全面和深入的工具和方法。