摘要

本文旨在探討電轉(zhuǎn)法（電穿孔法）在修飾的信使核糖核酸（modRNA）細胞轉(zhuǎn)染中的應用效果及相關(guān)特性。通過優(yōu)化電轉(zhuǎn)參數(shù)，實現(xiàn)了在HEK293和HeLa細胞系中高效的modRNA轉(zhuǎn)染，并評估了轉(zhuǎn)染效率、細胞活力及基因表達水平。本研究為modRNA在基因功能研究、細胞治療等領(lǐng)域的進一步應用提供了實驗基礎(chǔ)。

引言

在現(xiàn)代分子生物學與細胞生物學研究領(lǐng)域，將外源核酸分子高效地導入細胞內(nèi)是一項極為關(guān)鍵的技術(shù)手段。其中，modRNA修飾技術(shù)的出現(xiàn)為基因表達調(diào)控、疾病治療等多方面研究開辟了新的途徑。而實現(xiàn)modRNA在細胞內(nèi)的有效轉(zhuǎn)染則成為發(fā)揮其功能的首要步驟。傳統(tǒng)的細胞轉(zhuǎn)染方法包括脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、磷酸鈣沉淀法等，但這些方法存在轉(zhuǎn)染效率低、細胞毒性大等缺點。電轉(zhuǎn)法作為一種廣泛應用的細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)，具有更好的優(yōu)勢，本文旨在初步探索其在modRNA細胞轉(zhuǎn)染中的應用效果及相關(guān)特性。

構(gòu)建電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)化體系的意義

電轉(zhuǎn)法基于電場作用使細胞膜通透性瞬間改變，從而促使外源物質(zhì)進入細胞。相較于傳統(tǒng)方法，電轉(zhuǎn)法具有適用細胞范圍廣、轉(zhuǎn)染效率較高等優(yōu)點，在DNA轉(zhuǎn)染等方面已有諸多成功應用案例。然而，將電轉(zhuǎn)法應用于modRNA轉(zhuǎn)染仍需要深入探究其轉(zhuǎn)染參數(shù)、對細胞生理狀態(tài)的影響等多方面因素，以便為modRNA在基因功能研究、細胞治療等領(lǐng)域的進一步應用奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

1. 細胞培養(yǎng)

本研究選用了常見的細胞系，如HEK293細胞與HeLa細胞。HEK293細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中，在37°C、5% CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。HeLa細胞則采用含15%FBS、1%谷氨酰胺的RPMI-1640培養(yǎng)基，同樣在37°C、5% CO?條件下培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期后用于后續(xù)實驗。

2. modRNA合成

采用體外轉(zhuǎn)錄合成的方法制備modRNA。首先，根據(jù)目標基因序列設(shè)計并合成相應的DNA模板，在轉(zhuǎn)錄反應體系中加入T7 RNA聚合酶、NTP混合物以及修飾核苷酸等成分，在適宜的溫度與緩沖條件下進行轉(zhuǎn)錄反應。反應結(jié)束后，利用無RNase的DNase I去除DNA模板，然后通過RNA純化試劑盒對轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行純化，獲得高純度的modRNA。經(jīng)紫外分光光度計測定其濃度與純度，確保用于轉(zhuǎn)染實驗的modRNA質(zhì)量符合要求。

3. 電轉(zhuǎn)參數(shù)設(shè)置與操作

選用威尼德電轉(zhuǎn)儀，設(shè)置多組電轉(zhuǎn)參數(shù)進行實驗。包括不同的電壓強度（如100V-300V）、脈沖時間（如5ms-20ms）以及脈沖次數(shù)（1-3次）等組合。將處于對數(shù)生長期的細胞收集，用預冷的電轉(zhuǎn)緩沖液重懸，調(diào)整細胞密度至合適濃度。將適量的modRNA與細胞懸液混合后加入電轉(zhuǎn)杯，按照設(shè)定的電轉(zhuǎn)參數(shù)進行電擊操作。電擊后，立即將細胞轉(zhuǎn)移至預熱的完整培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，在不同時間點（如24小時、48小時、72小時）收集細胞進行后續(xù)檢測。

實驗結(jié)果

1. 轉(zhuǎn)染效率檢測

采用熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測modRNA的轉(zhuǎn)染效率。在modRNA轉(zhuǎn)錄過程中，將熒光素酶基因序列整合其中。通過檢測細胞內(nèi)熒光素酶的活性來反映modRNA的轉(zhuǎn)染效率。在轉(zhuǎn)染后的不同時間點，收集細胞，裂解后加入熒光素酶底物，利用酶標儀測定發(fā)光強度，與標準曲線對比計算出相對熒光素酶活性，從而確定轉(zhuǎn)染效率。

在HEK293細胞的電轉(zhuǎn)實驗中發(fā)現(xiàn)，電壓強度、脈沖時間和脈沖次數(shù)等電轉(zhuǎn)參數(shù)對modRNA轉(zhuǎn)染效率有著顯著影響。當電壓為200V、脈沖時間為10ms、脈沖次數(shù)為2次時，在轉(zhuǎn)染后48小時檢測到相對較高的熒光素酶活性，表明此時的轉(zhuǎn)染效率較高。而在較低電壓（如100V）或過高電壓（如300V）時，轉(zhuǎn)染效率均明顯下降。類似地，脈沖時間過長或過短以及脈沖次數(shù)不適宜都會導致轉(zhuǎn)染效率降低。在HeLa細胞中也呈現(xiàn)出相似的規(guī)律，但最佳電轉(zhuǎn)參數(shù)略有不同，為電壓250V、脈沖時間15ms、脈沖次數(shù)2次。

2. 細胞活力檢測

運用CCK-8法測定細胞活力。在電轉(zhuǎn)后不同時間，向細胞培養(yǎng)孔中加入CCK-8試劑，在細胞培養(yǎng)箱中孵育一定時間后，利用酶標儀測定450nm處的吸光度值。根據(jù)吸光度值的變化評估電轉(zhuǎn)過程對細胞活力的影響，以未電轉(zhuǎn)的細胞作為對照，計算細胞活力百分比。

CCK-8法檢測結(jié)果顯示，電轉(zhuǎn)過程在一定程度上會影響細胞活力。與未電轉(zhuǎn)的對照組相比，在電轉(zhuǎn)后24小時，細胞活力有較為明顯的下降，尤其是在較高電壓或較長脈沖時間的電轉(zhuǎn)條件下。但隨著時間推移，細胞活力逐漸恢復，到72小時時，部分電轉(zhuǎn)組細胞活力已接近對照組水平。這表明細胞對電轉(zhuǎn)操作具有一定的自我修復能力，但過度的電場刺激仍會對細胞造成較為嚴重的損傷。

3. 基因表達水平檢測

利用實時定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)目標基因的表達水平。提取電轉(zhuǎn)后細胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后以特異性引物進行qRT-PCR擴增反應。通過與內(nèi)參基因（如GAPDH）的表達量對比，計算目標基因的相對表達量，分析modRNA轉(zhuǎn)染后在細胞內(nèi)的基因表達調(diào)控效果。

qRT-PCR檢測結(jié)果表明，成功轉(zhuǎn)染modRNA后，細胞內(nèi)目標基因的表達水平顯著升高。在最佳電轉(zhuǎn)參數(shù)條件下，轉(zhuǎn)染后24小時即可檢測到目標基因表達量的明顯增加，并且在48小時-72小時內(nèi)維持在較高水平。這說明通過電轉(zhuǎn)法導入的modRNA能夠在細胞內(nèi)有效地進行翻譯表達，發(fā)揮其基因調(diào)控功能。

討論

1. 電轉(zhuǎn)法用于modRNA細胞轉(zhuǎn)染的可行性

本研究初步探索了電轉(zhuǎn)法在modRNA細胞轉(zhuǎn)染中的應用，結(jié)果顯示電轉(zhuǎn)法在合適的參數(shù)條件下能夠?qū)崿F(xiàn)較高的modRNA轉(zhuǎn)染效率，并且能夠有效調(diào)控細胞內(nèi)基因表達。這表明電轉(zhuǎn)法是一種可行的modRNA轉(zhuǎn)染方法，為modRNA在基因功能研究、細胞治療等領(lǐng)域的進一步應用提供了實驗基礎(chǔ)。

2. 電轉(zhuǎn)參數(shù)的優(yōu)化

電轉(zhuǎn)參數(shù)對modRNA轉(zhuǎn)染效率具有顯著影響。本研究通過篩選不同電壓強度、脈沖時間和脈沖次數(shù)等組合，找到了在HEK293和HeLa細胞系中轉(zhuǎn)染modRNA的最佳電轉(zhuǎn)參數(shù)。然而，不同細胞系的最佳電轉(zhuǎn)參數(shù)存在差異，這提示我們在實際應用中需要根據(jù)細胞類型進行電轉(zhuǎn)參數(shù)的優(yōu)化。未來研究可以開發(fā)智能化的電轉(zhuǎn)設(shè)備，能夠根據(jù)細胞類型自動調(diào)整電轉(zhuǎn)參數(shù)，提高轉(zhuǎn)染效率并減少對細胞的損害。

3. 電轉(zhuǎn)法對細胞生理狀態(tài)的影響

電轉(zhuǎn)過程在一定程度上會影響細胞活力，但細胞具有自我修復能力。本研究發(fā)現(xiàn)，在較高電壓或較長脈沖時間的電轉(zhuǎn)條件下，細胞活力明顯下降，但隨著時間推移，細胞活力逐漸恢復。這表明在合適的電轉(zhuǎn)參數(shù)下，電轉(zhuǎn)法對細胞的損傷是可控的。未來研究可以進一步探究減輕細胞損傷的方法，如優(yōu)化電轉(zhuǎn)緩沖液成分等。

4. 研究的創(chuàng)新與應用前景

本研究創(chuàng)新地將電轉(zhuǎn)法應用于modRNA細胞轉(zhuǎn)染，并通過優(yōu)化電轉(zhuǎn)參數(shù)實現(xiàn)了高效的轉(zhuǎn)染效率。這為modRNA在基因治療、細胞工程等領(lǐng)域的廣泛應用提供了新的技術(shù)手段。未來研究可以結(jié)合其他新興技術(shù)，如納米技術(shù)，探索新的modRNA轉(zhuǎn)染策略，以克服電轉(zhuǎn)法當前存在的不足，推動modRNA技術(shù)的進一步發(fā)展。

結(jié)論

本研究初步探索了電轉(zhuǎn)法在modRNA細胞轉(zhuǎn)染中的應用，結(jié)果顯示電轉(zhuǎn)法在合適的參數(shù)條件下能夠?qū)崿F(xiàn)較高的modRNA轉(zhuǎn)染效率，并且能夠有效調(diào)控細胞內(nèi)基因表達。然而，電轉(zhuǎn)法也存在一些局限性，如細胞活力的影響和電轉(zhuǎn)參數(shù)的優(yōu)化等。未來研究可以從減輕細胞損傷、優(yōu)化電轉(zhuǎn)參數(shù)和開發(fā)智能化電轉(zhuǎn)設(shè)備等方面展開，以推動modRNA技術(shù)在基因治療、細胞工程等領(lǐng)域的廣泛應用。

本研究為modRNA的細胞轉(zhuǎn)染提供了新的技術(shù)手段，為modRNA在基因功能研究、疾病治療等方面的進一步應用奠定了實驗基礎(chǔ)。隨著技術(shù)的不斷進步和創(chuàng)新，電轉(zhuǎn)法在modRNA細胞轉(zhuǎn)染中的應用前景將更加廣闊。