摘要：本研究旨在探討肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（hepatocyte growth factor, HGF）基因通過(guò)腎臟電轉(zhuǎn)染方法對(duì)大鼠腎缺血再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury, IRI）的保護(hù)作用。通過(guò)構(gòu)建hHGF基因表達(dá)載體，并利用威尼德電轉(zhuǎn)染系統(tǒng)將其導(dǎo)入大鼠腎臟，觀察其對(duì)腎功能、組織學(xué)改變及細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果表明，hHGF基因電轉(zhuǎn)染能有效減輕腎缺血再灌注損傷，為腎保護(hù)提供新的策略。

引言

腎缺血再灌注損傷是臨床腎臟移植、腎臟部分切除術(shù)及主動(dòng)脈瘤手術(shù)等過(guò)程中的常見(jiàn)并發(fā)癥，嚴(yán)重影響腎臟功能及患者預(yù)后。肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）作為一種多功能生長(zhǎng)因子，具有顯著的抗纖維化、促血管生成及抗凋亡作用，對(duì)腎臟具有保護(hù)作用。然而，外源性HGF半衰期短，需頻繁給藥，限制了其臨床應(yīng)用?；蛑委煘榻鉀Q這一問(wèn)題提供了新思路。

本研究通過(guò)構(gòu)建hHGF基因表達(dá)載體，并利用腎臟電轉(zhuǎn)染技術(shù)，將hHGF基因直接導(dǎo)入大鼠腎臟，探討其對(duì)腎缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，旨在為臨床腎保護(hù)提供新的策略。

材料與方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性Sprague-Dawley大鼠（體重250-300g）購(gòu)自某實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房，自由飲水進(jìn)食。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)指導(dǎo)原則。

質(zhì)粒構(gòu)建

采用PCR方法從大鼠肝臟組織中擴(kuò)增hHGF基因編碼區(qū)序列，克隆至pcDNA3.1（+）載體中，構(gòu)建hHGF基因表達(dá)質(zhì)粒（pcDNA3.1-hHGF）。質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證無(wú)誤后，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

電轉(zhuǎn)染試劑與設(shè)備

采用某試劑公司的電轉(zhuǎn)染試劑及威尼德電轉(zhuǎn)染儀進(jìn)行腎臟電轉(zhuǎn)染。

實(shí)驗(yàn)分組

將大鼠隨機(jī)分為三組：假手術(shù)組（Sham組）、缺血再灌注組（IRI組）及hHGF基因電轉(zhuǎn)染組（hHGF組）。每組10只大鼠。

手術(shù)操作

大鼠經(jīng)腹腔注射麻醉后，行右側(cè)腎切除術(shù)。Sham組僅暴露左側(cè)腎臟，不進(jìn)行夾閉；IRI組及hHGF組暴露左側(cè)腎臟后，用無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉左腎動(dòng)脈45分鐘，松開夾子恢復(fù)血流，建立腎缺血再灌注模型。hHGF組在缺血前3天，經(jīng)腎動(dòng)脈注射pcDNA3.1-hHGF質(zhì)粒（50μg/只），并使用威尼德電轉(zhuǎn)染儀進(jìn)行腎臟電轉(zhuǎn)染，參數(shù)設(shè)置為電壓100V，脈沖長(zhǎng)度50ms，脈沖間隔50ms，脈沖次數(shù)5次。

標(biāo)本采集與檢測(cè)

再灌注24小時(shí)后，腹腔注射過(guò)量處死大鼠，采集血液及左側(cè)腎臟組織。血液用于檢測(cè)血清肌酐（Scr）和尿素氮（BUN）水平；腎臟組織部分用于HE染色觀察組織學(xué)改變，部分用于TUNEL染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡，部分用于Western blot檢測(cè)HGF蛋白表達(dá)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

腎功能檢測(cè)

與Sham組相比，IRI組血清Scr和BUN水平顯著升高（P<0.01）；而hHGF組血清Scr和BUN水平較IRI組明顯降低（P<0.05），但仍高于Sham組（P<0.05）。

組織學(xué)觀察

HE染色結(jié)果顯示，Sham組腎小管結(jié)構(gòu)清晰，上皮細(xì)胞完整；IRI組腎小管上皮細(xì)胞腫脹、壞死，管腔擴(kuò)張，間質(zhì)充血水腫；hHGF組腎小管損傷程度較IRI組減輕，上皮細(xì)胞腫脹減輕，管腔擴(kuò)張程度降低 。

細(xì)胞凋亡檢測(cè)

TUNEL染色結(jié)果顯示，Sham組腎小管上皮細(xì)胞未見(jiàn)凋亡細(xì)胞；IRI組腎小管上皮細(xì)胞凋亡細(xì)胞增多；hHGF組腎小管上皮細(xì)胞凋亡細(xì)胞數(shù)量較IRI組減少 。

Western blot檢測(cè)

Western blot結(jié)果顯示，hHGF組腎臟組織中HGF蛋白表達(dá)水平較Sham組和IRI組顯著升高（P<0.01）。

討論

本研究通過(guò)構(gòu)建hHGF基因表達(dá)載體，并利用腎臟電轉(zhuǎn)染技術(shù)，成功將hHGF基因?qū)氪笫竽I臟，觀察其對(duì)腎缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，hHGF基因電轉(zhuǎn)染能有效減輕腎缺血再灌注損傷，改善腎功能，減輕組織學(xué)改變及細(xì)胞凋亡。

腎臟電轉(zhuǎn)染作為一種非病毒基因轉(zhuǎn)移方法，具有操作簡(jiǎn)便、高效、安全等優(yōu)點(diǎn)。本研究采用威尼德電轉(zhuǎn)染儀進(jìn)行腎臟電轉(zhuǎn)染，通過(guò)優(yōu)化電轉(zhuǎn)染參數(shù)，實(shí)現(xiàn)了hHGF基因在腎臟組織中的高效表達(dá)。Western blot結(jié)果顯示，hHGF組腎臟組織中HGF蛋白表達(dá)水平顯著升高，證實(shí)了hHGF基因成功轉(zhuǎn)染并表達(dá)。

HGF作為一種多功能生長(zhǎng)因子，具有顯著的抗纖維化、促血管生成及抗凋亡作用。本研究結(jié)果顯示，hHGF基因電轉(zhuǎn)染能有效減輕腎缺血再灌注損傷，改善腎功能。這可能與HGF促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡、減輕炎癥反應(yīng)及促進(jìn)血管生成等作用有關(guān)。HE染色及TUNEL染色結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了hHGF基因?qū)δI缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。

本研究為腎缺血再灌注損傷的基因治療提供了新的策略。然而，本研究仍存在一些局限性。首先，實(shí)驗(yàn)僅觀察了hHGF基因電轉(zhuǎn)染對(duì)短期腎缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，未探討其對(duì)長(zhǎng)期腎功能的影響。其次，實(shí)驗(yàn)未對(duì)hHGF基因在腎臟組織中的分布及持續(xù)表達(dá)時(shí)間進(jìn)行深入研究。未來(lái)研究可進(jìn)一步探討hHGF基因在腎臟組織中的分布特點(diǎn)、持續(xù)表達(dá)時(shí)間及其對(duì)長(zhǎng)期腎功能的影響，為臨床應(yīng)用提供更為詳實(shí)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

此外，本研究采用的腎臟電轉(zhuǎn)染方法雖然操作簡(jiǎn)便、高效，但仍存在一定的組織損傷風(fēng)險(xiǎn)。未來(lái)研究可探索更為安全、高效的基因轉(zhuǎn)移方法，如超聲微泡介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移、納米載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移等，以提高基因治療的安全性和有效性。

創(chuàng)新與應(yīng)用前景

本研究創(chuàng)新性地采用腎臟電轉(zhuǎn)染技術(shù)將hHGF基因?qū)氪笫竽I臟，探討其對(duì)腎缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，為腎保護(hù)提供了新的策略。hHGF基因電轉(zhuǎn)染具有操作簡(jiǎn)便、高效、安全等優(yōu)點(diǎn)，有望成為腎缺血再灌注損傷基因治療的新方法。

在臨床應(yīng)用方面，hHGF基因電轉(zhuǎn)染可用于腎臟移植、腎臟部分切除術(shù)及主動(dòng)脈瘤手術(shù)等過(guò)程中的腎保護(hù)。通過(guò)術(shù)前或術(shù)中給予hHGF基因電轉(zhuǎn)染，可有效減輕腎缺血再灌注損傷，改善腎功能，降低術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生率，提高患者預(yù)后。此外，hHGF基因電轉(zhuǎn)染還可用于慢性腎臟病、急性腎損傷等疾病的治療，為腎臟疾病的基因治療提供新的思路。

結(jié)論

本研究通過(guò)構(gòu)建hHGF基因表達(dá)載體，并利用腎臟電轉(zhuǎn)染技術(shù)，成功將hHGF基因?qū)氪笫竽I臟，觀察其對(duì)腎缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，hHGF基因電轉(zhuǎn)染能有效減輕腎缺血再灌注損傷，改善腎功能，減輕組織學(xué)改變及細(xì)胞凋亡。本研究為腎缺血再灌注損傷的基因治療提供了新的策略，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。未來(lái)研究可進(jìn)一步探討hHGF基因在腎臟組織中的分布特點(diǎn)、持續(xù)表達(dá)時(shí)間及其對(duì)長(zhǎng)期腎功能的影響，為臨床應(yīng)用提供更為詳實(shí)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。