摘要

本研究通過(guò)小細(xì)胞團(tuán)和分散細(xì)胞混合物與兩種帶不同質(zhì)粒的農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，成功將外源基因?qū)胴暩腆w胚，并通過(guò)DNA/DNA分子雜交鑒定確認(rèn)基因整合與表達(dá)。構(gòu)建了基于轉(zhuǎn)化體胚的人工種子，并初步探討了其萌發(fā)能力。本研究為柑桔類果樹外源基因轉(zhuǎn)移和遺傳改良提供了重要參考。

引言

特性與價(jià)值

貢柑（Citrus nobilis Lour. Gonggan）是我國(guó)的柑橘地方農(nóng)家優(yōu)良品種，具有果形靚麗、果色金黃、皮薄核少、肉脆化渣、高糖低酸等特點(diǎn)，被譽(yù)為“中華柑王"。其優(yōu)良的品質(zhì)和更好的口感使得貢柑在市場(chǎng)上受到廣泛歡迎，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

構(gòu)建遺傳轉(zhuǎn)化體系的意義

隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，通過(guò)外源基因?qū)敫牧甲魑锲贩N已成為現(xiàn)代育種的重要手段。構(gòu)建貢柑的遺傳轉(zhuǎn)化體系，不僅可以提高貢柑的抗病蟲害能力、耐逆境能力等，還可以實(shí)現(xiàn)對(duì)其品質(zhì)性狀的定向改良，從而滿足市場(chǎng)對(duì)高品質(zhì)柑橘的需求。

材料與方法

實(shí)驗(yàn)材料

1. 植物材料：選取健康、生長(zhǎng)旺盛的貢柑植株，取其幼胚作為外植體。

2. 農(nóng)桿菌菌株：攜帶質(zhì)粒PGV3850:1103neo T-DNA（包含km抗性基因和Nos/Npt基因）和質(zhì)粒PGV517（包含Km抗性基因、NPTⅡ基因和毒蛋白基因）的農(nóng)桿菌。

3. 培養(yǎng)基：含有卡那霉素的選擇培養(yǎng)基，用于篩選抗性愈傷組織和幼胚。

實(shí)驗(yàn)方法

1. 外植體準(zhǔn)備：取貢柑幼胚，經(jīng)過(guò)消毒處理后，用小細(xì)胞團(tuán)和分散細(xì)胞混合物作為外植體。

2. 共培養(yǎng)：將外植體與兩種帶不同質(zhì)粒的農(nóng)桿菌進(jìn)行共培養(yǎng)，使外源基因?qū)胴暩碳?xì)胞。

3. 選擇培養(yǎng)：在含有卡那霉素的選擇培養(yǎng)基上選擇出抗性愈傷組織和幼胚。

4. 基因整合與表達(dá)檢測(cè)：通過(guò)Nopalim和NPTⅡ酶性檢測(cè)、DNA/DNA分子雜交鑒定，確認(rèn)外源基因是否整合到貢柑體胚的細(xì)胞基因組中并表達(dá)。

5. 人工種子制備：用3%海藻酸鈉包埋轉(zhuǎn)化體胚制備人工種子，并觀察其萌發(fā)情況。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

抗性愈傷組織和幼胚的篩選

經(jīng)過(guò)選擇培養(yǎng)，成功從共培養(yǎng)的外植體中篩選出具有卡那霉素抗性的愈傷組織和幼胚。這些抗性組織在后續(xù)的培養(yǎng)中保持了良好的生長(zhǎng)狀態(tài)。

基因整合與表達(dá)鑒定

通過(guò)Nopalim和NPTⅡ酶性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)部分抗性愈傷組織和幼胚具有NPTⅡ酶活性，表明NPTⅡ基因已成功導(dǎo)入并表達(dá)。進(jìn)一步的DNA/DNA分子雜交鑒定結(jié)果顯示，Nos基因、NPTⅡ基因以及蘇云金桿菌的毒蛋白基因已整合到貢柑體胚的細(xì)胞基因組中。

人工種子制備與萌發(fā)

用3%海藻酸鈉包埋轉(zhuǎn)化體胚制備了人工種子。在適宜的萌發(fā)條件下，2粒轉(zhuǎn)基因人工種子成功萌發(fā)，表明所制備的人工種子具有萌發(fā)能力。

討論

外植體關(guān)鍵因素

外植體的選擇對(duì)于誘導(dǎo)體細(xì)胞胚的發(fā)生至關(guān)重要。在本研究中，選取了貢柑的幼胚作為外植體，這是因?yàn)橛着呔哂休^高的細(xì)胞全能性和胚性潛力，易于誘導(dǎo)形成體胚。此外，幼胚的發(fā)育程度對(duì)胚性愈傷組織的誘導(dǎo)也起決定性作用，因此在選擇外植體時(shí)需要嚴(yán)格控制其發(fā)育階段。

遺傳轉(zhuǎn)化策略

本研究采用了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，成功將外源基因?qū)胴暩腆w胚。這種方法具有操作簡(jiǎn)便、轉(zhuǎn)化效率高等優(yōu)點(diǎn)，是植物基因工程領(lǐng)域常用的轉(zhuǎn)化策略之一。在轉(zhuǎn)化過(guò)程中，質(zhì)粒的選擇和農(nóng)桿菌菌株的侵染能力是影響轉(zhuǎn)化效率的關(guān)鍵因素。本研究通過(guò)優(yōu)化共培養(yǎng)條件和篩選高侵染力的農(nóng)桿菌菌株，提高了外源基因的導(dǎo)入效率。

研究的創(chuàng)新與應(yīng)用前景

1. 創(chuàng)新點(diǎn)：本研究在柑桔類果樹中實(shí)現(xiàn)了外源基因的轉(zhuǎn)移和表達(dá)，并成功構(gòu)建了基于轉(zhuǎn)化體胚的人工種子。這一研究成果不僅豐富了柑桔類果樹的遺傳轉(zhuǎn)化體系，還為后續(xù)的品質(zhì)改良和抗病蟲害育種提供了重要參考。

2. 應(yīng)用前景：通過(guò)外源基因的導(dǎo)入，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)貢柑品質(zhì)性狀的定向改良，如提高糖度、降低酸度、增強(qiáng)抗病蟲害能力等。此外，人工種子的制備為貢柑的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供了新的途徑，有望降低生產(chǎn)成本、提高生產(chǎn)效率。

結(jié)論

本研究通過(guò)小細(xì)胞團(tuán)和分散細(xì)胞混合物與兩種帶不同質(zhì)粒的農(nóng)桿菌共培養(yǎng)的方法，成功將外源基因?qū)胴暩腆w胚，并通過(guò)DNA/DNA分子雜交鑒定確認(rèn)了基因的整合與表達(dá)。同時(shí)，構(gòu)建了基于轉(zhuǎn)化體胚的人工種子，并初步探討了其萌發(fā)能力。這一研究成果為柑桔類果樹的外源基因轉(zhuǎn)移和遺傳改良提供了重要參考，具有廣闊的應(yīng)用前景。