摘要： 電穿孔和電融合技術(shù)在生命科學領(lǐng)域的重要性、基本原理以及具體操作流程。通過深入分析這兩項技術(shù)的機制和步驟，為相關(guān)研究人員提供全面且深入的理論支持和實踐指導(dǎo)，促進其在細胞操作、基因轉(zhuǎn)染、遺傳改良等方面的應(yīng)用和發(fā)展。
在生命科學的快速發(fā)展進程中，電穿孔和電融合技術(shù)作為先進的細胞操作手段，發(fā)揮著不可缺失的作用。它們?yōu)榧毎飳W、分子生物學、遺傳學等多個領(lǐng)域的研究提供了強有力的工具，使我們能夠在細胞水平上進行精確的操作和研究，深入理解細胞的生理功能、遺傳特性以及細胞間的相互作用。本文將對這兩項技術(shù)的原理及流程進行深入探討。
電穿孔技術(shù)基于細胞膜的電學特性和對電場的響應(yīng)機制。細胞膜作為細胞的重要屏障，具有一定的電容和電阻特性。當細胞處于外加電場中時，細胞膜兩側(cè)會形成跨膜電位差。隨著電場強度的增加和作用時間的延長，跨膜電位差逐漸增大。當達到一個臨界值時，細胞膜的脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)會發(fā)生局部擾動，形成一些微小的孔隙，這一現(xiàn)象被稱為電穿孔。這些孔隙的形成使得細胞內(nèi)外的物質(zhì)能夠通過細胞膜進行交換，從而為外源物質(zhì)（如 DNA、RNA、蛋白質(zhì)等）進入細胞提供了通道。
選擇合適的細胞類型：根據(jù)實驗?zāi)康暮鸵螅x取具有特定生物學特性的細胞，如原代細胞、細胞系等。
細胞培養(yǎng)：將細胞接種于適宜的培養(yǎng)基中，在合適的溫度、濕度和氣體環(huán)境下進行培養(yǎng)，使其處于良好的生長狀態(tài)并達到一定的細胞密度。通常在細胞對數(shù)生長期進行電穿孔操作，此時細胞活性較高，對電穿孔的耐受性相對較好。
收集細胞：用胰蛋白酶等消化酶將細胞從培養(yǎng)容器表面分離下來，然后通過離心等方法收集細胞沉淀，并用適當?shù)木彌_液（如磷酸鹽緩沖液 PBS）洗滌細胞，以去除培養(yǎng)基中的雜質(zhì)和血清成分，避免其對電穿孔過程產(chǎn)生干擾。
選擇合適的緩沖液成分：電穿孔緩沖液的主要作用是維持細胞的滲透壓和離子平衡，同時提供適宜的離子環(huán)境以促進電穿孔的發(fā)生。常用的緩沖液成分包括無機鹽（如 NaCl、KCl 等）、糖類（如葡萄糖）和緩沖劑（如 Hepes 等）。根據(jù)不同的細胞類型和實驗需求，可以對緩沖液的成分和濃度進行優(yōu)化調(diào)整。
調(diào)整 pH 值和滲透壓：將緩沖液的 pH 值調(diào)節(jié)至與細胞內(nèi)環(huán)境相近的范圍（一般為 7.2 - 7.4），以保證細胞在緩沖液中的活性和穩(wěn)定性。同時，通過添加適量的溶質(zhì)來調(diào)整緩沖液的滲透壓，使其與細胞內(nèi)液滲透壓相當，防止細胞在電穿孔過程中因滲透壓變化而受到損傷。例如，對于大多數(shù)哺乳動物細胞，緩沖液的滲透壓可調(diào)整在 280 - 320 mOsm/kg 之間。
過濾除菌：將配制好的電穿孔緩沖液通過 0.22 µm 或 0.45 µm 的濾膜進行過濾除菌，以去除緩沖液中的細菌和其他微生物污染物，確保電穿孔過程在無菌條件下進行。
電場強度：電場強度是電穿孔過程中的關(guān)鍵參數(shù)之一，它直接影響電穿孔的效果和細胞的存活率。電場強度的選擇應(yīng)根據(jù)細胞類型、細胞大小、緩沖液成分以及外源物質(zhì)的性質(zhì)等因素進行優(yōu)化。一般來說，較小的細胞和較低濃度的外源物質(zhì)需要較高的電場強度，而較大的細胞和較高濃度的外源物質(zhì)則需要相對較低的電場強度。電場強度的單位通常為伏特 / 厘米（V/cm），其取值范圍在幾百到幾千 V/cm 之間。對于常見的哺乳動物細胞，電場強度一般在 500 - 1500 V/cm 之間。
脈沖寬度：脈沖寬度是指電場作用于細胞的時間長度，它也對電穿孔效果有重要影響。較長的脈沖寬度可以增加孔隙的形成和維持時間，有利于外源物質(zhì)的進入，但同時也會增加細胞的損傷風險；較短的脈沖寬度則可能導(dǎo)致孔隙形成不完整，影響電穿孔效率。脈沖寬度的單位通常為微秒（µs）或毫秒（ms），其取值范圍在幾個微秒到幾十毫秒之間。對于大多數(shù)細胞，脈沖寬度在 10 - 50 µs 之間較為合適。
脈沖次數(shù)：脈沖次數(shù)是指電場對細胞施加脈沖的次數(shù)。增加脈沖次數(shù)可以提高電穿孔效率，但也會進一步增加細胞的損傷程度。因此，脈沖次數(shù)的選擇需要在電穿孔效率和細胞存活率之間進行平衡。一般情況下，脈沖次數(shù)在 1 - 5 次之間較為常見。
設(shè)置電擊杯類型：根據(jù)實驗需要選擇合適的電擊杯，電擊杯的尺寸和形狀會影響電場的分布和細胞的排列方式。常見的電擊杯有不同的容量（如 0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL 等）和電極間距，應(yīng)根據(jù)細胞數(shù)量和電穿孔儀的要求進行選擇。
將細胞懸浮于電穿孔緩沖液中：將收集并洗滌好的細胞沉淀重新懸浮于適量的電穿孔緩沖液中，調(diào)整細胞濃度至合適的范圍（一般為 1×10? - 1×10? 個 /mL）。細胞濃度過高會導(dǎo)致細胞之間相互作用增強，影響電場分布和電穿孔效果；細胞濃度過低則會浪費外源物質(zhì)和實驗資源。
加入外源物質(zhì)：將需要導(dǎo)入細胞的外源物質(zhì)（如 DNA 質(zhì)粒、RNA 分子、蛋白質(zhì)等）加入到細胞懸浮液中，輕輕混勻。外源物質(zhì)的加入量應(yīng)根據(jù)實驗?zāi)康暮图毎愋瓦M行優(yōu)化，過多的外源物質(zhì)可能會對細胞產(chǎn)生毒性，而過少則可能無法達到預(yù)期的實驗效果。
將細胞 - 外源物質(zhì)混合液轉(zhuǎn)移至電擊杯：使用移液器將細胞 - 外源物質(zhì)混合液小心地轉(zhuǎn)移至預(yù)先冷卻的電擊杯中，避免產(chǎn)生氣泡。確?；旌弦壕鶆蚍植荚陔姄舯碾姌O之間，以保證電場能夠均勻作用于細胞。
進行電穿孔操作：將電擊杯正確插入電穿孔儀的插槽中，按照設(shè)定好的參數(shù)啟動電穿孔儀進行電擊操作。在電擊過程中，應(yīng)密切觀察電穿孔儀的運行狀態(tài)和電擊杯中的細胞情況，確保操作順利進行。
電穿孔后處理：電擊完成后，立即將電擊杯從電穿孔儀中取出，將細胞懸浮液轉(zhuǎn)移至預(yù)先準備好的含有適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)容器中（如培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶等）。將培養(yǎng)容器放置在細胞培養(yǎng)箱中，在合適的條件下進行培養(yǎng)，使細胞恢復(fù)生長并表達導(dǎo)入的外源物質(zhì)。在培養(yǎng)過程中，應(yīng)定期觀察細胞的生長狀態(tài)和存活情況，并根據(jù)需要進行后續(xù)的實驗分析和檢測。
電融合技術(shù)是利用電場誘導(dǎo)細胞之間發(fā)生融合的方法。當兩個或多個細胞在適當?shù)碾妶鲎饔孟戮o密接觸時，細胞膜會發(fā)生極化現(xiàn)象，使得細胞的接觸區(qū)域形成局部的高電場強度區(qū)域。在這種高電場強度的作用下，細胞膜的脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)會發(fā)生紊亂和重排，導(dǎo)致細胞膜的通透性增加并逐漸融合在一起，最終形成一個融合細胞。電融合技術(shù)可以實現(xiàn)同種細胞之間的融合（如體細胞融合），也可以用于不同種細胞之間的融合（如細胞雜交），為細胞工程和遺傳操作提供了一種有效的手段。
細胞來源和類型選擇：與電穿孔技術(shù)類似，根據(jù)實驗?zāi)康倪x擇合適的細胞來源和類型。例如，在進行體細胞融合實驗時，可以選取來自同一組織或器官的不同類型的體細胞；在進行細胞雜交實驗時，則需要選擇具有不同遺傳特性的兩種細胞進行融合。
細胞培養(yǎng)和處理：對選取的細胞進行培養(yǎng)，使其達到良好的生長狀態(tài)和適宜的細胞密度。在進行電融合操作前，需要對細胞進行適當?shù)奶幚?，以提高細胞的融合效率。例如，可以使用胰蛋白酶等消化酶將細胞制成單細胞懸液，并通過離心和洗滌等步驟去除細胞表面的雜質(zhì)和殘留的培養(yǎng)基成分。此外，還可以對細胞進行預(yù)處理，如用某些化學試劑（如聚乙二醇 PEG）或生物因子（如仙臺病毒）處理細胞，使細胞的細胞膜變得更加柔軟和易于融合。
緩沖液成分選擇：電融合緩沖液的成分與電穿孔緩沖液類似，但通常需要根據(jù)細胞融合的特點進行一些調(diào)整。除了包含維持細胞滲透壓和離子平衡的無機鹽、糖類和緩沖劑外，還可以添加一些有助于細胞融合的成分，如鈣離子（Ca2?）等。鈣離子可以促進細胞膜的融合過程，提高融合效率。
pH 值和滲透壓調(diào)節(jié)：將電融合緩沖液的 pH 值調(diào)節(jié)至適宜的范圍（一般為 7.0 - 7.4），以保證細胞在緩沖液中的活性和穩(wěn)定性。同時，調(diào)整滲透壓使其與細胞內(nèi)液滲透壓相近，通常在 280 - 320 mOsm/kg 之間。
過濾除菌：采用與電穿孔緩沖液相同的方法對電融合緩沖液進行過濾除菌，確保緩沖液的無菌性。
交流電場參數(shù)：在電融合過程中，首先需要施加一個交流電場，其作用是使細胞在電場中排列成串，并促進細胞之間的緊密接觸。交流電場的參數(shù)包括電壓、頻率和作用時間。電壓的選擇應(yīng)根據(jù)細胞類型和大小進行調(diào)整，一般在幾十伏到幾百伏之間。頻率通常在幾百赫茲到幾千赫茲之間，作用時間為幾十秒到幾分鐘不等。較高的電壓和頻率可以使細胞更快地排列成串，但也可能對細胞造成損傷；較低的電壓和頻率則需要較長的作用時間，但細胞的存活率相對較高。因此，需要在實驗中對這些參數(shù)進行優(yōu)化，以找到適合的條件。
直流脈沖電場參數(shù)：在細胞排列成串并緊密接觸后，需要施加一個直流脈沖電場來誘導(dǎo)細胞膜的融合。直流脈沖電場的參數(shù)主要包括電場強度、脈沖寬度和脈沖次數(shù)。電場強度一般在幾百伏 / 厘米到幾千伏 / 厘米之間，脈沖寬度在幾十微秒到幾百微秒之間，脈沖次數(shù)通常為 1 - 3 次。這些參數(shù)的選擇也需要根據(jù)細胞類型、細胞狀態(tài)以及實驗?zāi)康倪M行優(yōu)化，以獲得較高的融合效率和細胞存活率。
將細胞懸浮于電融合緩沖液中：將經(jīng)過處理的細胞以適當?shù)臐舛葢腋∮陔娙诤暇彌_液中，細胞濃度一般為 1×10? - 1×10? 個 /mL。確保細胞懸浮液均勻，避免細胞團聚。
將細胞懸浮液加入電融合室：使用移液器將細胞懸浮液小心地加入到電融合室中，電融合室通常是一個具有特殊電極結(jié)構(gòu)的容器，可以在電場作用下實現(xiàn)細胞的排列和融合。加入細胞懸浮液時應(yīng)注意避免產(chǎn)生氣泡，以免影響電場分布和細胞融合效果。
施加交流電場：啟動電融合儀，按照設(shè)定好的交流電場參數(shù)施加交流電場。在交流電場的作用下，細胞會逐漸排列成串，并相互緊密接觸。觀察細胞在電融合室中的排列情況，確保細胞排列均勻且緊密接觸。如果細胞排列不理想，可以適當調(diào)整電場參數(shù)或重新進行操作。
施加直流脈沖電場：當細胞排列成串并緊密接觸后，切換到直流脈沖電場模式，按照設(shè)定好的參數(shù)施加直流脈沖電場。在直流脈沖電場的作用下，細胞膜會發(fā)生融合，形成融合細胞。在施加直流脈沖電場過程中，應(yīng)密切觀察細胞的融合情況和電融合儀的運行狀態(tài)，確保操作順利進行。
融合后處理：電融合操作完成后，將融合細胞從電融合室中取出，轉(zhuǎn)移至含有適宜培養(yǎng)基的培養(yǎng)容器中進行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件應(yīng)根據(jù)融合細胞的類型和特性進行調(diào)整，以促進融合細胞的生長和增殖。在培養(yǎng)過程中，需要定期觀察融合細胞的生長狀態(tài)和融合效果，并進行后續(xù)的實驗分析和檢測，如融合細胞的形態(tài)觀察、染色體分析、基因表達檢測等，以評估電融合技術(shù)的效果和融合細胞的生物學特性。
電穿孔和電融合技術(shù)作為生命科學領(lǐng)域中重要的細胞操作技術(shù)，具有廣泛的應(yīng)用前景和深遠的研究意義。通過深入理解其原理和掌握詳細的操作流程，我們能夠更加準確地運用這兩項技術(shù)進行細胞工程、基因治療、遺傳改良等方面的研究和應(yīng)用。然而，這兩項技術(shù)在實際應(yīng)用中仍面臨一些挑戰(zhàn)，如電穿孔和電融合效率的進一步提高、細胞存活率的優(yōu)化、對不同細胞類型的適用性拓展等。未來的研究需要不斷探索和創(chuàng)新，進一步完善這兩項技術(shù)的理論和方法，使其在生命科學研究和實際應(yīng)用中發(fā)揮更大的作用，為推動生命科學的發(fā)展做出更大的貢獻。
